הספרייה הגדולה של אלכסנדריה באלכסנדריה, מצרים, הייתה אחת הספריות הגדולות והחשובות ביותר בעולם העתיק. הספרייה הייתה חלק ממוסד מחקר גדול יותר שנקרא מוזיאון (Mouseion), שהוקדש למוזות, תשע אלות האמנויות.
הרעיון של ספרייה אוניברסלית באלכסנדריה הוצע ככל הנראה על ידי דמטריוס מפלרום, מדינאי אתונאי גולה שחי באלכסנדריה, לתלמי הראשון סוטר, שאולי הניח את התוכניות לספרייה, אך הספרייה עצמה כנראה לא נבנתה עד תקופת שלטונו של בנו, תלמי השני פילדלפוס. הספרייה רכשה במהירות מגילות פפירוס רבות, בעיקר בשל המדיניות האגרסיבית והמתוקצבת היטב של המלכים התלמיים להשגת טקסטים.
לא ידוע בדיוק כמה מגילות כאלה אוחסנו בה בכל זמן נתון, אך ההערכות נעות בין 40,000 ל-400,000 בשיאה.
מעט מאוד ידוע על הספרייה של אלכסנדריה בתקופת הפרינקיפט הרומי (27 לפנה"ס – 284 לספירה). הקיסר קלאודיוס (מלך בשנים 41–54 לספירה) מתועד כמי שבנה תוספת לספרייה, אך נראה כי גורלה הכללי של הספרייה של אלכסנדריה הלך בעקבות גורלה של העיר אלכסנדריה עצמה.
אותו הדבר היה כנראה נכון גם לגבי משרת הספרן הראשי; הספרן הראשי היחיד הידוע מהתקופה הרומית היה אדם בשם טיבריוס קלאודיוס בלבּילוס, שחי באמצע המאה הראשונה לספירה והיה פוליטיקאי, מנהל וקצין צבאי ללא תיעוד של הישגים מלומדים משמעותיים.
אזכורים מפוזרים מצביעים על כך שבמהלך המאה הרביעית, מוסד המכונה "מוזיאון" עשוי היה לקום מחדש במיקום אחר כלשהו באלכסנדריה. עם זאת, לא ידוע דבר על מאפייניו של ארגון זה.
המקור המוקדם ביותר הידוע ששרד על ייסוד הספרייה של אלכסנדריה הוא איגרת אריסטיאס הפסאודואפיגרפית, שנכתבה בין השנים 180 ל-145 לפנה"ס לערך.
היא טוענת שהספרייה נוסדה בתקופת שלטונו של תלמי הראשון סוטר (בערך 323–283 לפנה"ס) ושהיא אורגנה בתחילה על ידי דמטריוס מפלרום, תלמידו של אריסטו שהוגלה מאתונה ומצא מקלט באלכסנדריה בחצר התלמית.
הספרן הראשי הראשון שתועד היה זנודוטוס מאפסוס. עבודתו העיקרית של זנודוטוס הוקדשה לביסוס טקסטים קנוניים עבור שירי הומרוס ומשוררים ליריים יוונים מוקדמים. רוב מה שידוע עליו מגיע מפרשנויות מאוחרות יותר המזכירות את הקריאות המועדפות עליו בקטעים מסוימים.
זנודוטוס ידוע בכך שכתב מילון של מילים נדירות ויוצאות דופן, שאורגן לפי סדר אלפביתי, מה שהופך אותו לאדם הראשון הידוע שהשתמש בסדר אלפביתי כשיטת ארגון.
לאחר שזנודוטוס מת או פרש, תלמי השני פילדלפוס מינה את אפולוניוס מרודוס (חי בערך 295–215 לפנה"ס), יליד אלכסנדריה ותלמידו של קאלימאכוס, לספרן הראשי השני של הספרייה של אלכסנדריה.
פילדלפוס מינה גם את אפולוניוס מרודוס לחונך של בנו, תלמי השלישי אוורגטס לעתיד.
הספרייה של אלכסנדריה לא הייתה קשורה לאף אסכולה פילוסופית מסוימת, וכתוצאה מכך, לחוקרים שלמדו בה הייתה חופש אקדמי ניכר. עם זאת, הם היו כפופים לסמכותו של המלך.
סיפור אחד, ככל הנראה אפוקריפי, מסופר על משורר בשם סוטאדס שכתב אפיגרמה גסה שלעגה לתלמי השני על כך שנשא לאישה את אחותו ארסינואי השנייה. נאמר שתלמי השני כלא אותו, ולאחר שברח, כלא אותו בכד עופרת והשליך אותו לים.
לאחר קרב רפיח בשנת 217 לפנה"ס, השלטון התלמי הפך לבלתי יציב יותר ויותר. היו התקוממויות בקרב פלגים של האוכלוסייה המצרית, ובמחצית הראשונה של המאה השנייה לפנה"ס, הקשר עם מצרים העליונה השתבש במידה רבה. שליטים תלמיים החלו גם להדגיש את הפן המצרי של אומתם על פני הפן היווני.
כתוצאה מכך, חוקרים יוונים רבים החלו לעזוב את אלכסנדריה למדינות בטוחות יותר עם פטרונות נדיבה יותר.
תלמי השביעי נרצח וירש אותו תלמי השמיני פיסקון, שהחל מיד להעניש את כל אלו שתמכו בקודמו, מה שאילץ את אריסטרכוס לברוח ממצרים ולמצוא מקלט באי קפריסין, שם מת זמן קצר לאחר מכן.
תלמיד נוסף של אריסטרכוס, אפולודורוס מאתונה (כ-180 – כ-110 לפנה"ס), עבר ליריבתה הגדולה ביותר של אלכסנדריה, פרגמון, שם לימד וערך מחקר. תפוצה זו הניעה את ההיסטוריון מנקלס מברקה להעיר בסרקזם שאלכסנדריה הפכה למורה של כל היוונים והברברים כאחד.
תלמידו של אריסטרכוס, דיוניסיוס תראקס (כ-170 – כ-90 לפנה"ס), הקים בית ספר באי היווני רודוס. דיוניסיוס תראקס כתב את הספר הראשון על דקדוק יווני, מדריך תמציתי לדיבור וכתיבה ברורים ואפקטיביים. ספר זה נותר ספר הלימוד העיקרי לדקדוק עבור תלמידי בית ספר יוונים עד המאה ה-12 לספירה. הרומאים ביססו את כתביהם הדקדוקיים עליו, והפורמט הבסיסי שלו נותר הבסיס למדריכי דקדוק בשפות רבות גם כיום.
כמה מהתלמיים המאוחרים יותר השתמשו במשרת הספרן הראשי כפרס פוליטי בלבד כדי לתגמל את תומכיהם המסורים ביותר.
תלמי השמיני מינה אדם בשם סידאס, אחד משומרי ארמונו, לספרן ראשי.
תלמי התשיעי סוטר השני (מלך בשנים 88–81 לפנה"ס) נתן ככל הנראה את המשרה לתומך פוליטי. בסופו של דבר, משרת הספרן הראשי איבדה כל כך הרבה מיוקרתה הקודמת עד שאפילו סופרים בני התקופה חדלו להתעניין בתיעוד תקופות הכהונה של ספרנים ראשיים בודדים.
בשנת 48 לפנה"ס, במהלך מלחמת האזרחים של קיסר, יוליוס קיסר היה נצור באלכסנדריה. חייליו הציתו כמה מהספינות המצריות שעגנו בנמל אלכסנדריה בניסיון לפנות את הרציפים כדי לחסום את הצי של תלמי ה-14, אחיה של קלאופטרה.
שריפה זו התפשטה כביכול לחלקים של העיר הקרובים ביותר לרציפים, וגרמה להרס ניכר.
יתרה מכך, פלוטרכוס מתעד בחיבורו 'חיי מרקוס אנטוניוס' כי בשנים שקדמו לקרב אקטיום בשנת 33 לפנה"ס, נפוצו שמועות שמרקוס אנטוניוס נתן לקלאופטרה את כל 200,000 המגילות שבספריית פרגמון.
פלוטרכוס עצמו מציין כי המקור שלו לאנקדוטה זו לא היה אמין לעיתים, וייתכן שהסיפור אינו אלא תעמולה שנועדה להראות שמרקוס אנטוניוס היה נאמן לקלאופטרה ולמצרים ולא לרומא.
קאסון, לעומת זאת, טוען שאפילו אם הסיפור הומצא, הוא לא היה אמין אלא אם כן הספרייה עדיין הייתה קיימת. אדוארד ג'. ווטס טוען כי ייתכן שהמתנה של מרקוס אנטוניוס נועדה לחדש את אוסף הספרייה לאחר הנזק שנגרם לה על ידי השריפה של קיסר כעשור וחצי קודם לכן.