Martinho Lutero lançou o que mais tarde seria conhecido como a Reforma

Além dos conflitos entre suas heranças espanhola e alemã, conflitos religiosos seriam outra fonte de tensão durante o reinado de Carlos V. Antes do início do reinado de Carlos no Sacro Império Romano-Germânico, em 1517, Martinho Lutero lançou o que mais tarde seria conhecido como a Reforma. Nessa época, muitos duques locais viram isso como uma chance de se opor à hegemonia do Imperador Carlos V. O império então ficou fatalmente dividido por linhas religiosas, com o norte, o leste e muitas das principais cidades – Estrasburgo, Frankfurt e Nuremberg – tornando-se protestantes, enquanto as regiões sul e oeste permaneceram em grande parte católicas.

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