لا يُعرف الكثير عن مكتبة الإسكندرية خلال فترة الإمبراطورية الرومانية (27 ق.م - 284 م). تم تسجيل أن الإمبراطور كلوديوس (حكم من 41 إلى 54 بعد الميلاد) قام ببناء إضافة إلى المكتبة، ولكن يبدو أن الثروة العامة لمكتبة الإسكندرية اتبعت ثروات مدينة الإسكندرية نفسها.
ومن الواضح أن الأمر نفسه كان كذلك حتى بالنسبة لمنصب رئيس مكتبة. كان رئيس المكتبات الوحيد المعروف من العصر الروماني رجلًا يُدعى تيبيريوس كلوديوس بالبيليوس، عاش في منتصف القرن الأول الميلادي وكان سياسيًا ومسؤولًا وضابطًا عسكريًا مع عدم وجود سجل لإنجازات علمية كبيرة.
في عام 272 بعد الميلاد، حارب الإمبراطور أوريليان لاستعادة مدينة الإسكندرية من قوات ملكة بالميرين زنوبيا.
تشير المراجع المتفرقة إلى أنه في وقت ما من القرن الرابع، ربما تم إعادة تأسيس مؤسسة تُعرف باسم "موزيون" "Mouseion" في مكان مختلف في مكان ما في الإسكندرية. ومع ذلك، لا شيء معروف عن خصائص هذه المنظمة.
في عام 642 م، استولى الجيش المسلم بقيادة عمرو بن العاص على الإسكندرية. وصفت عدة مصادر عربية لاحقة تدمير المكتبة بأمر من الخليفة عمر بن الخطاب.
أقدم مصدر معروف باقٍ للمعلومات عن تأسيس مكتبة الإسكندرية هو رسالة مزيفة لأريستاس ، والتي تم تأليفها في الفترة ما بين 180 و145 ق.م.
تدعي أن المكتبة تأسست في عهد بطليموس الأول سوتر (حوالي 323 - 283 قبل الميلاد) وأنه تم تنظيمها في البداية من قبل ديمتريوس الفاليروم، طالب أرسطو الذي تم نفيه من أثينا ولجأ إلى الإسكندرية في الداخل.
كان أول أمين مكتبة مسجَّل هو زينودوتوس. تم تكريس عمل زينودوتوس الرئيسي لإنشاء نصوص قانونية لقصائد هومري والشعراء الغنائيين اليونانيين الأوائل. يأتي معظم ما هو معروف عنه من التعليقات اللاحقة التي تذكر قراءاته المفضلة لمقاطع معينة.
من المعروف أن زينودوتوس كتب مسردًا للكلمات النادرة وغير العادية، والذي تم تنظيمه حسب الترتيب الأبجدي، مما جعله أول شخص معروف باستخدام الترتيب الأبجدي كوسيلة للتنظيم.
بعد وفاة زينودوتوس أو تقاعده، عين بطليموس الثاني فيلادلفوس أبولونيوس من رودس (عاش حوالي 295 - 215 قبل الميلاد)، وهو من مواليد الإسكندرية وتلميذ كاليماخوس، كأمين مكتبة الإسكندرية الثاني.
كما عين فيلادلفوس أبولونيوس من رودس كمعلم لابنه، بطليموس الثالث يورجتس.
لم تكن مكتبة الإسكندرية تابعة لأي مدرسة فلسفية معينة، وبالتالي كان للعلماء الذين درسوا هناك حرية أكاديمية كبيرة. لكنهم كانوا خاضعين لسلطة الملك.
تُروى إحدى القصص المشكوك فيها على الأرجح عن شاعر يُدعى سوتاديس كتب قصيدة فاحشة يسخر من بطليموس الثاني لزواجه من أخته أرسينوي الثاني. يقال إن بطليموس الثاني سجنه، وبعد أن هرب، أغلقه في جرة من الرصاص وأسقطه في البحر.
اشتهر رئيس المكتبة الثالث، إراتوستينس القيرواني (الذي عاش حوالي 280 - 194 قبل الميلاد)، اليوم بأعماله العلمية، لكنه كان أيضًا عالمًا أدبيًا.
بعد معركة رافيا في 217 قبل الميلاد، أصبحت قوة البطالمة غير مستقرة بشكل متزايد. كانت هناك انتفاضات بين قطاعات من السكان المصريين، وفي النصف الأول من القرن الثاني قبل الميلاد، تعطل الاتصال بصعيد مصر إلى حد كبير.
بدأ حكام البطالمة أيضًا في التأكيد على الجانب المصري لأمتهم على الجانب اليوناني.
ونتيجة لذلك، بدأ العديد من العلماء اليونانيين في مغادرة الإسكندرية إلى بلدان أكثر أمانًا برعاية أكثر سخاء.
أريستوفانيس البيزنطي (عاش حوالي 257 - 180 قبل الميلاد) أصبح رابع أمين مكتبة في وقت ما حوالي 200 قبل الميلاد.
كان أريستارخوس ساموثراكي (عاش حوالي 216 - 145 قبل الميلاد) سادس رئيس أمين مكتبة.
ومع ذلك، في عام 145 قبل الميلاد، وقع أريستارخوس في صراع أسري حيث دعم بطليموس السابع نيوس فيلوباتور كحاكم لمصر.
قُتل بطليموس السابع وخلفه بطليموس الثامن فيسكون، الذي شرع على الفور في معاقبة كل من دعم سلفه، مما أجبر أريسترخوس على الفرار من مصر واللجوء إلى جزيرة قبرص، حيث توفي بعد ذلك بوقت قصير.
ذهب تلميذ آخر من تلاميذ أريستارخوس، وهو أبولودوروس الأثيني (حوالي 180 - 110 قبل الميلاد)، إلى أكبر منافس للإسكندرية، بيرغاموم، حيث قام بالتدريس وإجراء البحوث.
دفع هذا الشتات المؤرخ مينكليز بارس إلى التعليق ساخرًا على أن الإسكندرية أصبحت معلمة لجميع الإغريق والبرابرة على حد سواء.
أنشأ تلميذ أريستارخوس "ديونيسيوس ثراكس" (حوالي 170 - 90 قبل الميلاد) مدرسة في جزيرة رودس اليونانية. كتب ديونيسيوس ثراكس أول كتاب عن قواعد اللغة اليونانية "فن القواعد"، وهو دليل موجز للتحدث والكتابة بوضوح وفعالية.
ظل هذا الكتاب هو كتاب القواعد الأساسي لطلاب المدارس اليونانية حتى أواخر القرن الثاني عشر الميلادي. بنى الرومان كتاباتهم النحوية عليها، ولا يزال شكلها الأساسي هو الأساس لأدلة القواعد في العديد من اللغات حتى اليوم.
استخدم العديد من البطالمة في وقت لاحق منصب أمين المكتبة الرئيسي باعتباره مجرد برقوق سياسي لمكافأة مؤيديهم الأكثر تفانيًا.
عين بطليموس الثامن رجلاً يدعى سيداس، أحد حراس قصره، أمين مكتبة.
يقال إن بطليموس التاسع سوتر الثاني (حكم من 88 إلى 81 قبل الميلاد) قد أعطى هذا المنصب لمؤيد سياسي. في نهاية المطاف، فقد منصب رئيس المكتبات الكثير من هيبته السابقة لدرجة أن المؤلفين المعاصرين توقفوا عن الاهتمام بتسجيل فترات عمل أمناء المكتبات الفردية.
في عام 48 قبل الميلاد، أثناء حرب قيصر الأهلية، حاصر يوليوس قيصر في الإسكندرية. أشعل جنوده النار في بعض السفن المصرية الراسية في ميناء الإسكندرية أثناء محاولتهم إخلاء الأرصفة لمنع الأسطول الخاص بشقيق كليوباترا بطليموس الرابع عشر.
يُزعم أن هذا الحريق انتشر إلى أجزاء المدينة الأقرب إلى الأرصفة، مما تسبب في دمار كبير.
علاوة على ذلك ، سجل بلوتارخ في كتابه "حياة مارك أنتوني" أنه في السنوات التي سبقت معركة أكتيوم في عام 33 قبل الميلاد ، ترددت شائعات عن أن مارك أنتوني أعطى كليوباترا جميع ال 200,000 مخطوطة في مكتبة بيرغاموم.
يلاحظ بلوتارخ نفسه أن مصدره لهذه الحكاية كان في بعض الأحيان غير موثوق به ومن المحتمل أن القصة قد لا تكون أكثر من دعاية تهدف إلى إظهار أن مارك أنتوني كان مخلصًا لكليوباترا ومصر وليس لروما.
ومع ذلك، يجادل كاسون بأنه حتى لو تم اختلاق القصة، فلن تكون قابلة للتصديق ما لم تكن المكتبة موجودة. يجادل إدوارد واتس بأن هدية مارك أنطوني ربما كانت تهدف إلى تجديد مجموعة المكتبة بعد الأضرار التي لحقت بها بسبب حريق قيصر قبل عقد ونصف تقريبًا.